本文参考了部分文献及《植物研究进展》、《植物科学最前沿》公众号的三篇文章。
本文主要以本人所做的水稻NBS-LRR基因家族的分析为例。
1. 基因家族的鉴定
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首先根据pfam数据库中NBS-LRR基因家族的的保守结构域NBS（PF00931）信息，利用HMMER软件构建种子序列，并对日本晴全基因组蛋白质序列进行搜索，如果存在该结构域，则判定为NBS-LRR候选基因；
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接着，使用PFAM、PANTHER、SUPERFAMILY等数据库对候选基因进行进一步确认；
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需要注意的是，对于部分在Pfam数据库里没有被收录的基因家族，我们只能在模式植物，如拟南芥中搜集已知的基因家族成员序列，然后在自己研究的物种中进行序列比对，从而对基因家族成员进行鉴定。（摘录于植物研究进展）
2. 进行染色体定位和基因簇划分
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首先提取候选基因集的gene locus信息，使用MapInspect等绘图软件绘制其染色体定位信息；
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gene cluster的划分原则：two or more NBS-LRR genes locus resided within 200 kb。
3. 构建系统进化树和加倍复制分析
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系统进化树的绘制可以使用MEGA7.0软件，为了方便对基因进行分类，应该选取日本晴中的NBS-LRR家族及拟南芥中的NBS-LRR家族一起来分析，图例如下：
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利用MCScanX软件可以做共线性分析，如下：
4. 基因结构和motif分析
利用MEME绘制基因的外显子和内含子位置信息，以及基因序列上的motif信息，并将这些基因结构信息按照系统进化树的顺序进行展示。
5. 水稻和拟南芥蛋白家族基因的同源性分析
拟南芥中NBS-LRR蛋白功能研究较为完善，进行水稻与拟南芥间NBS-LRR蛋白同源性分析有助于解析水稻中NBS-LRR蛋白的功能，具体信息见下图：
6. 蛋白家族启动子区域顺式作用元件分析
具体可以使用PLANTCARE来挖掘基因中的顺势元件。
7. 基因多重序列比对、GO注释
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多重序列比对可以使用CLUSTAL OMEGA软件；
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GO注释可以使用水稻基因组注释文件或WEGO在线。
8. 基因家族启动子及表达模式分析（以毛竹bHLH为例）
由于那篇文章研究的基因家族是转录因子，所以可以对家族内基因启动子区域进行分析，这也是本文分析比较具有亮点的部分；bHLH基因家族所含有的顺式作用元件共可划分为3类：一是光周期响应原件；二是植物生长发育响应原件；三是生物/非生物胁迫响应原件。
9. 基因在不同处理下的差异表达分析及可视化（和基因表达量数据的结合）
- 结合相关的高通量测序数据，观察我们所获得的基因在其中的表达量的变化，可以使用heatmap图进行可视化展示：
10. qRT-PCR检测胁迫环境下NBS-LRR基因表达模式变化
基因家族的主体分析内容完成之后，还可以结合qPCR等基因表达数据进行进一步挖掘。
