参考资料：Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程
1. 知识回顾
CRISPR（clustered，regularly interspaced，short palindromic repeats）是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中I类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas 蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9 首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。
2. 目前常用的CAS9研究方法流程及操作步骤
CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图
实验前，请您务必做好以下验证实验：
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A.单细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可 以形成单克隆。
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B.目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要 PCR 扩增靶基因，并对 PCR 结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用 RT-PCR 分析靶基因的活跃度。
2.1 设计 Oligo DNA 序列
首先，您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 20bp 左右的 oligo DNA，您可以通过以下在线工具设计：
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麻省理工学院的 CRISPR Design：http://crispr.mit.edu/
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德国癌症研究中心的 E-Crisp：www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr
下面我们选择麻省理工学院的 CRISPR Design 工具来做设计举例，以 Fut8 基因为例，一次只能输入大小为 23～250bp 的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免 Guide 序列跨内含子的。
点击“Download as genbank”按钮，出现以下界面：“Fut8”
根据左边的 score 的高低选取合适的 Guide 序列，以 Guide#1 序列为例，2 条单链 oligo 的序列如下（红色字体部分是要与 BbsI 酶切后的载体相互补的部分）：
注意：oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G，如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G，可自行加一个G上去。
另外，需在位点上下游各设计一条引物，用于后续 PCR 或测序检测阳性克隆，引物能扩增约 300bp的 DNA 片段，上游引物距突变位点约 100bp，下游引物距突变位点约 200bp。
将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为 PAGE。
2.2 T4 DNA Ligase 连接
将合成后的 2 条单链 oligo DNA 退火形成双链 DNA，再与载体连接，pGK1.1 linear vector 是线性化载体，无需酶切处理，可直接用于 T4 DNA Ligase 连接反应，pGK1.1 载体已经优化过，其转染和敲除的效率比一般CRISPR载体更高。
退火反应体系如下：
将以上体系瞬时离心后，置于PCR仪中95℃孵育3min，孵育后自然冷却20min。取1.75μl的杂交后的双链DNA进行T4 DNA Ligase连接反应，反应体系如下：
注意：请您根据步骤1自行设计正链Oligo序列和负链Oligo序列，合成后的2条单链 oligo DNA退火复性成双链DNA，再进行T4 DNA Ligase连接反应。
连接产物可以直接转化DH5a高效感受态细胞，转化和筛选阳性克隆的实验步骤请您参考《分子克隆实验指南》，pGK1.1的抗性为卡那霉素抗性，筛选后的阳性克隆，需测序验证序列的正确性。
2.3 电转染靶细胞(推荐)
转染前进行质粒大提，确保质粒浓度≥2μg/μl浓度，再取4～7μg进行电转染靶细胞，推荐使用Celetrix细胞电转仪(型号：CTX-1500A)，贴壁细胞的数量需1x106～3x106，悬浮细胞的数量需3x106～5x106。
另外，您也可以使用转染试剂转染靶细胞。
2.4 混合克隆pool检测
48-72小时后做有限稀释，一般5块板足够，并取电转后细胞的pool 1000个细胞以上离心，去上清，PBS洗一遍，细胞沉淀溶于适量的PBS中，煮5min后模板就制备好了，剩余的pool细胞冻存。
PCR检测（以Fut8基因为例）：
程序：
PCR产物使用CruiserTM酶切15-20分钟，酶切产物1%-1.5%凝胶电泳。
上图为混合克隆pool酶切检测，由此图可知此混合克隆pool中有敲除成功的细胞，则进行下一步并计算突变率。
2.5 Cruiser™筛选阳性克隆
将剩余的pool的靶细胞有限稀释后，分到96孔板中进行单克隆培养，如果靶细胞是悬浮细胞，推荐使用Cell Plaza™(Cat.No.: GP08250)培养细胞，待细胞长好后，取1000个左右的细胞，提基因组，推荐使用Genloci TNA抽提试剂盒 (Cat.No.: GL10851S)。
然后使用核酸内切酶初步筛选阳性克隆，推荐使用Genloci Cruiser™突变检测试剂盒(Cat.Nos.: GCMD025, GCMD100)，对Cruiser™筛选后的阳性克隆进行测序分析，并对碱基缺失结果进行比对分析。
3. FAQ
Q-1：靶位点设计有哪些注意事项
目前有几个在线设计软件，我们推荐使用 Zhang Feng lab：http://crispr.mit.edu/，该软件会对每一个潜在的靶位点打分，并告知是否存在脱靶现象。在设计 Guide 序列时，需要特别注意第一个碱基必须是G，如果您选取的 Guide 序列的第一个碱基不是 G，需要自行加上一个 G，因为这个 G 对于起始转录非常重要。
Q-2：转染效率低，怎么办？
因为 Cas9 蛋白比较大，就导致整个敲除质粒较大（8kb 左右），如此大的质粒很容易导致转化效率低下，尤其是使用脂质体等化学试剂转染时，转染效率会比较低些。所以，我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad 的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染 buffer，所以不推荐使用；Life 的 Neon 系统不错，但是因为耗材是镀金的，所以非常贵；而 Genloci 的 CTX-1500A 电转仪，转化效率高，不需要单独配制 buffer，只需使用无血清的培养基就行，而且该电转仪的耗材也是相对比较便宜的。
Q-3：单个细胞不生长，怎么办？
对于单细胞不长的细胞进行敲除，首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞；也可以使用 Cell PlazaTM（单细胞培养板），可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行，建议对细胞进行改造，加快其分裂速度，让单细胞可以很容易生长后，再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系 Genloci 的客服做进一步的了解。
Q-4：在做高通量样本时，如何才能快速筛选得到阳性克隆？
建议使用错配酶进行筛选，可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶：CruiserTM 酶、T7E I和 Surveyor 酶。其中，CruiserTM 酶和 Surveyor 酶属于 Cel I 家族，这两种酶的筛选特异性比 T7E I 高。在酶切筛选过程中，T7E1 的特异性较差，容易出现假阳性的结果，这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度；Surveyor 酶较贵，并且货期较长，所以我们推荐 CruiserTM 酶，它特异性高且价格合理。
4. 附录
4.1 pGK1.1 linear Vector
以下为pGK1.1的插入位点示意图和质粒图谱，线性化pGK1.1所用的酶为BbsI。
5. Cruiser™操作说明
5.1 操作步骤
1）基因组 DNA 的准备
提取细胞的基因组 DNA，推荐使用 Genloci 公司专为阳性克隆筛选设计的 TNA 抽提试剂盒（Cat. No.: GL10851S），只需 500 个左右的细胞即可提取全基因组 DNA，详细实验步骤请参看 Genloci TNA 抽提试 剂盒（Cat. No.: GL10851S）说明书。
2）杂交 DNA 的准备
a) 第一轮和第二轮（巢式）PCR 引物设计
分别设计 First Primers 和 Nested Primers。其中 First Primers 要求具有较高的特异性，其扩增产物推荐为 500～1000 bp，Nested Primers 推荐扩增产物长度为 300～600bp。First Primers 和 Nested Primers 引物对应目的序列的位置如下：
b) 第一轮 PCR：获得目的片段
将已经提取的基因组作为模板，使用 First Primers，以高保真 DNA 聚合酶扩增获得目的片段，要求目 的片段明亮（允许少量杂条带，以及少量弥散）。同时获得野生型模板扩增产物和突变型模板扩增产物。 推荐扩增循环数 35～40 cycles，反应体系 25 μl，100 ng≤模板量≤300 ng。PCR 完成后，取 7～8 μl 进行电泳检测。
c) 第二轮（巢式）PCR：获得杂交 DNA
根据第一轮 PCR 电泳检测中目的条带的亮度，用无菌去离子水稀释扩增产物（可参照 Marker 的亮度，估算产物中 DNA 的浓度，稀释至总核酸浓度为 10～20 ng/μl，一般需要稀释 10～50 倍）。其中野生型模 板扩增产物标记为：WT DNA；待检测的突变型模板扩增产物标记为：MT DNA；根据您的检测样本量的大 小取合适量的稀释产物作为第二轮 PCR 的模板。
小量样本的反应体系如下：
大量样本的反应体系如下：
注意：
若第一轮 PCR 的扩增模板为混合模板，即同时含有野生型和突变型模板，则在第二轮 PCR 无需混合 WT DNA，取稀释后的扩增产物 2 μl 作为第二轮 PCR 的模板。
GNest DNA polymerase 置于-20℃保存，且避免操作污染。在 60 s 内，GNest DNA polymerase 可扩 增 1 kb 的 DNA 片段。
PCR 反应程序推荐如下：
Tm 值由 Nested Primer 决定，一般为 55℃左右。
产物片段长度≤500 bp 时，建议为 72℃，15 s；产物片段长度＞500 bp 时，建议为 72℃，30 s。 扩增结束后，取 2 μl PCR 产物（实验组）用于下一步 CruiserTM 酶切检测。
3）CruiserTM 酶筛选阳性克隆
对照组和实验组杂交 DNA 同时进行 CruiserTM 酶切，步骤如下：
- 取一个新的 0.20 ml 的 PCR 反应管，加入 2 μl Positive control DNA，此为阳性对照组；
- 分别向实验组和对照组反应管中加入 CruiserTM 核酸酶和 5×CruiserTM 缓冲液，总体积为 10 μl，移 液器吹打混匀，此步骤应置于冰浴上操作。酶切体系如下：
- 将实验组和对照组置于 PCR 仪中 45℃孵育 15～20 min。
注意：CruiserTM 核酸酶、阳性对照置于-20℃保存，且避免操作污染。
5. 结果分析
酶切步骤结束后，应向上述 10 μl 反应体系内加入 2μl 6×Stop Buffer，随后进行琼脂糖电泳检测或置 于-20℃保存。当酶切后片段预计<500 bp 时，推荐使用 1.5%～2%的琼脂糖凝胶电泳，若酶切片段的大小 相近且需要将其分开显示，可提高琼脂糖凝胶浓度并延长电泳时间，凝胶最大浓度推荐≤2.5%。
试剂盒中 Positive Control DNA 为杂交后的 DNA 片段，经 CruiserTM 核酸酶切割后形成三个明显片段， 分别为 393 bp、134 bp、259 bp，其中 134 bp 和 259 bp 片段是酶切后片段，而 393 bp 片段为杂交形成 的 homo-duplex DNA 片段，无酶切割位点，因此，片段大小不变。
注意：酶切验证阳性的克隆，若需要进行测序，需以第一轮 PCR 产物为模板，使用相应的高保真 DNA 聚合酶、Nested Primer 引物进行扩增，回收片段送测序即可。
6. FAQ
Q-1：电泳结果仅有原片段而无酶切条带？
造成该实验结果有以下几种可能：
- a．DNA 片段中无突变位点，需要重新进行上游实验，可通过对该 DNA 片段进行测序验证；
- b．DNA 片段中杂交 DNA 含量过低，致使反应后条带不易观察到。该情况常见于 cell pool 检测中，因 cell pool 中阳性克隆(靶基因突变细胞)比例过低，导致获得 DNA 片段中杂交 DNA 含量过少，此时 建议设立 2-3 个重复分别进行 PCR 检测，只要检测到 CruiserTM 酶切条带，则可认为敲除成功，存 在阳性克隆。
- c．CruiserTM 核酸酶失活。使用试剂盒中的阳性对照同步进行实验以检测活性。
Q-2：电泳结果中酶切条带大小不是预期大小？
出现该情况表明制备的 DNA 片段中含有其他杂交位点。首先，应确认制备的 DNA 片段是否存在其他 DNA 的污染；其次，根据酶切结果进行判定：若酶切后形成的各条带单一，可能在 DNA 片段上含有其他 杂交位点，需通过 DNA 测序检测；若形成的酶切条带数量远多于预期，且随机分布含一定弥散，则可能是 DNA 片段扩增中，DNA 聚合酶错配扩增导致，使用高保真 DNA 聚合酶重新进行扩增可消除影响。如果 PCR 反应出现非特异性扩增的条带，也会导致同样情况，建议调整 PCR 反应条件，以保证只有特异性扩增的 PCR 产物用于突变检测。
Q-3：反应后，酶切的条带轻微弥散？
该现象可能原因如下：当酶切后条带<200 bp，且经较长时间的核酸电泳，条带宽度变大，亮度不足时呈现类似弥散的带型； 当突变位点过长，尤其当突变长度达到 50 bp 以上时，酶切后条带易出现弥散现象，此时弥散程度会因酶 切后条带大小的不同而不同，片段越小弥散情况越明显。
Q-4：CruiserTM Enzyme 检测结果是否会出现假阳性？
CruiserTM Enzyme 是通过基因工程生产的 Cel I 同源核酸内切酶，具有更好的稳定性、高度的特异性 和高效性，它能够切割所有形式的碱基突变形成的异源 DNA 双链。目前为止，尚未有文献报道使用 CruiserTM Enzyme 或 Cel I 会出现假阳性，或出现其他核酸酶活性。
Q-5：电泳结果中酶切条带大小与预期一致，就一定是纯合子吗？
因为杂交的 DNA 片段是通过巢式 PCR 得到的，所以特异性没有任何问题。在得到与预期一致的酶切 条带后，不能 100%判断该样本为纯合子，因为杂合子也能得出同样的结果。因此，需要进行 PCR 片段的 TA 克隆和测序验证。
7. 附录
7.1 附录A————阳性对照说明
等量野生型和突变型 DNA 片段混合，经 98℃加热、自然冷却后形成的杂交 DNA，该 DNA 链存在两 处突变，均为单碱基突变，突变点间距 2 bp，如下图所示。经 CruiserTM 核酸酶切割后形成三个明显片段， 分别为 393 bp、134 bp、259 bp，其中 134 bp、259 bp 为酶切形成的片段，393 bp 为杂交形成的 homo-duplex DNA 片段，无酶切割位点， 因此，片段大小不变。
阳性对照推荐用量：10 μl 体系用量 200 ng。
7.2 附录B————目的DNA制备说明
提取基因组 DNA 后，在设计 First Primers 用于第一轮 PCR 时，要求其具有较高的特异性，其扩增产 物推荐为 500～1000bp，Nested Primer 推荐扩增产物长度为 300～600 bp。在设计 Nested Primer 时，应使突变位点位于片段的 1/3～2/3 处，且反应后获得的片段大小不应小于 100 bp，以尽可能增强酶切结果的 可观察性。例如：使用第二轮（巢时）PCR 扩增获得全长为 400 bp 的 DNA 片段，通过调整引物位置，使 得预计的突变位点位于距 5’-端 140 bp 处，则 CruiserTM 核酸酶酶切后获得片段应为 140 bp、260 bp。若以1.5%～2.0%琼脂糖进行凝胶电泳检测则可获得 3 条清晰的片段，大小分别为 140 bp、260 bp、400 bp。
在进行 CRISPR-Cas9、TALEN 和 ZFN 技术进行基因敲除的检测时，推荐检测的 DNA 片段大小为 300～600 bp；若用于长片段扩增突变检测，片段大小不受限制，但需适当延长反应时间，如调节反应时间为 45min；片段在凝胶电泳时应呈现清晰的单一条带。
7.3 附录C————酶切效果说明
野生型和突变型模板 DNA 混合后进行巢式 PCR 是为了获得特异性的序列和足够的量，巢式 PCR 必须 采用试剂盒中的 5×Nested Buffer、Mg2+ Buffer 和 GNest DNA polymerase 进行反应，以确保不影响后续 CruiserTM 酶切反应。
