参考资料：CRISPR实验流程
一、利用Cas9质粒建立knock-out 细胞系实验的详细过程
- 1.1 确定待敲除基因的靶位点
- 1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNAOligo（引物）
- 1.3 构建表达sgRNA的质粒
- 1.4 sgRN活性检测
- 1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系
1.1 确定待敲除基因的靶位点
根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5和3侧翼序列。
1.2 设计识别靶位点的一对DNA Oligos
确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（http://erispr.mit.eduw），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。一般地，基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjaccnt Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos（同时设计检测目的基因的引物一起合成）。
1.3 构建可表达sgRNA的质粒
（Precut SgRWA Cloning kit and pSD-gRNA Plasmid构建试剂盒）
将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与我们提供的质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。次日在LB琼脂平板上，挑取单克隆6个，溶于20ulL液中，涡旋后，将部分菌液接种到LB液中，370C下250rpn生长，另部分的菌液用作模板进行快速PCR，经电泳确定阳性克隆后，将相对应的细菌送商业公司测序，同时将部分菌液接种到LB液体，370C下250rpn培养过夜。
1.4 sgRNA活性检测
1.4.1 sgRNA活性预检测–SSA活性检测
（Precut pSG-target Cloning kit&SSA assay检测试剂盒）
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SSA检测：根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率，客户也可以选购我公司Precut pSG-targct Cloning kit自行构建报告载体用于检测，我公司提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target质粒。
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检测原理：SSA报告质粒（pSG-targct）中luciferase基因被终止密码子提前终止，这种截短的luciferasc没有活性。为检测sgRNA的剪切活性，将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9和sgRNA的作用下，靶点位置的序列被有效剪切形成DSB，细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferasc（Figurc2），通过检测lucifcrase的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性（Figurc3）。
1.4.2 CRISPR剪切活性检测-surveyor
CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致，都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的应用中，活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有：靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法（Surveyor法）。
Surveyor法即错配酶法：靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（主要是CEL1或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas/sgRNA的活性。
1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系
将Cas9质粒转染细胞，如果细胞用脂质体转染困难，可采用电转。通过荧光标记观察转染效率，如果选择了带Nco抗性的质粒，则同时用G418药物筛选。如果有FACS，可直接分选带荧光的细胞。或者当细胞长满培养皿时，将细胞消化成单细胞，采用有限稀释法，接种96孔板。根据前述突变率决定克隆接种数量，由于Indel突变是随机突变。因此，其中的2/3应该是移码突变。如突变率=30%，则建议接种克隆数为96个，最终约有5个阳性克隆。
在荧光显微镜下观测细胞克隆生长情况，选择带有荧光的克隆，适时进行胰酶消化后，提取部分细胞的基因组DNA用作PCR模板。然后以前述引物和PCR条件进行PCR扩增。PCR产物先进行2%琼脂糖凝胶电泳，如果出现条带，则将PCR产物直接送测序。测序时，PCR产物无需切胶。待测序结果返回后，人工阅读测序色谱图。可确定基因是否突变以及突变基因的基因型。
将携带有双突变等位基因的阳性克隆扩增，保存，稳转系建立成功。
