参考资料：水稻多基因敲除系统–中国水稻研究所 王克剑实验室
1. 原理
利用Cas9 蛋白在多个gRNA 引导下对基因组多个特异区段产生双链断裂的特性，创制水稻基因组定点突变体（见图1）。
2. 系统特点
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快捷：编辑4个以内位点，可以进行载体的快速构建。
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高效：一次转化，高频率创制多突变体。
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无限：理论上可以同时编辑无限个基因。
3. 质粒（2个，见图2）
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pC1300-UBI:Cas9（最终载体，细菌中为卡那抗性，植物中为潮霉素抗性， UBI 启动子表达Cas9 蛋白）；
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SKm-gRNA（中间载体，细菌中为氨苄抗性，转录gRNA，gRNA 序列为优 化版）；
注：下文中提到的pC1300-Cas9 等同于pC1300-UBI:Cas9，SK-gRNA 等同 于SKm-gRNA 。
4. 步骤
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靶序列选择及引物设计
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单个中间载体构建
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多个中间载体聚合
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构建至最终载体
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转农杆菌转化
5. 具体步骤
5.1 靶序列选择及引物设计
5.2 单个中间载体构建
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A. SK-gRNA进行AarI酶切(Ferment公司)，形成带有粘性末端的载体;
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B. g++与g–引物混合后变性退火，形成带有粘末端的片段;
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C. 将载体和片段进行连接(摩尔浓度 1:3 -10) ,转化DH5a得到连接质粒；可用引物 T3与g– 搭配进行菌落PCR阳性检测 ;
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D. 利用公共引物T7或T3进行测序检测，验证是否正确。
5.3 多个中间载体聚合
利用 BamHI 和 BglII 是同尾酶的属性，进行无限个 SK-gRNA 中间载体的聚合。作为载体的用 KpnI 和 BamHI 进行酶切；提供片段的用 KpnI 和 BglII 进行酶切（见图 3）。此外，SK-gRNA 上还设计有两对同尾酶 NheI, XbaI, SalI, XhoI，用于 4 个之内 gRNA 的一步法快速连接。
Notes: 4 个之内的 gRNA 建议进行一步法快速连接，请参阅下面的示意图；
5.4 构建至最终载体
pC1300-Cas9 载体用 KpnI 和 BamHI 进行酶切。SK-gRNA 用 KpnI 和 BglII进行酶切并回收片段。并将片段连接到 pC1300-Cas9 载体上。
Notes: 建议终载体测序，以保证质粒构建正确。
如上图中，用测序引物 pC1300-F 可以检测 gRNA-4 序列是否正确，引物 g4 –可以检测 gRNA-3 序列是否正确，引物 g3 –可以检测 gRNA-2 序列是否正确，引物 g2 –可以检测 gRNA-1 序列是否正确。
pC1300-F 引物序列：acactttatgcttccggctc
5.5 转农杆菌转化水稻愈伤，获得转基因植株
5.6 突变检测
6. 附参考信息
6.1 pC1300-Cas9 载体图
6.2 SK-gRNA 载体图
6.3 SK-gRNA 插入外源片段处包含有两个 AarI 酶切位点
6.4 AarI(Ferment 公司产品)酶切 SK-gRNA 载体体系
6.5 引物退火成双链
合成的引物（g++，g–）用水稀释至浓度 100 M, 前引物和后引物各 20 L混合在一起，100℃ 5 分钟，室温冷却。
6.6 T4 连接酶
6.7 连接产物转化 DH5，菌落 PCR 检测出阳性克隆，送公司测序
6.8 终载体连接体系
6.9 一步法连 4 个 gRNA 的示意图
利用 SK-gRNA 载体上的三组同尾酶（BamHI & BglII, XbaI & NheI, XhoI & SalI），一步法组装 4 个 gRNA：
Notes：
1） 注意靶序列中避免后续用到的酶切位点。如有引入酶切位点，可以通过调换 gRNA 的连接顺序达到避免被酶切的目的。
2） 3 个以内的 gRNA 可一步法连接至最终载体。3 个 gRNA 依次分别用（KpnI/SalI）（XhoI/NheI）（XbaI/BglII）进行酶切获得片段, pC1300-Cas9 载体用 KpnI/BamHI 酶切。 2 个 gRNA 请根据情况自行选择内切酶进行一步法连接。
3） 如果只连 1 个 gRNA,可将 SK-gRNA 空载体(KpnI/BglII)连接到 pC1300-Cas9 载体上,这样就构成了单基因敲除载体 pC1300-Cas9-1gRNA（以后构建单基因敲除载体时只需 AarI单酶切，然后连接设计片段即可）。
4） 多于 4 个 gRNA 的可以通过 BamHI 和 BglII 这组同尾酶继续无限组装（见图 3）。以 8个 gRNA 为例：可将 gRNA 分成 2 组，1 组 4 个分别进行一步法连接，再将 2 个组合通过图 3 的方法拼接在一起。
