文章信息：Resource, Published: November 24, 2020
Highlights
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人类皮肤衰老的单细胞转录landscapes
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皮肤衰老过程中细胞类型特异性转录网络的失调
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HES1或KLF6的细胞类型特异性下调可加速衰老
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槲皮素促进衰老的皮肤成纤维细胞的再生
Summary
皮肤不断进行自我更新，其功能下降是衰老的明显后果。了解人类皮肤老化需要深入了解各种皮肤细胞类型的分子和功能特性。我们对来自不同年龄的健康个体的人眼睑皮肤进行了单细胞RNA测序，确定了11种规范细胞类型以及6种基础细胞亚群。进一步的分析表明，随着年龄的增长，光老化相关变化的累积和慢性炎症的增加。在衰老过程中，参与发育过程的转录因子发生了早期发作。此外，成纤维细胞中关键转录因子HES1和角质形成细胞中KLF6的抑制不仅损害细胞增殖，还增加衰老过程中的炎症和细胞衰老。最后，我们发现基因激活HES1或用槲皮素进行药物治疗可减轻皮肤成纤维细胞的衰老。这些发现提供了人类皮肤衰老的单细胞分子框架，为开发针对衰老相关的皮肤疾病的治疗策略提供了丰富的资源。
关键词
skin;aging;senescence;single-cell RNA sequencing;KLF6;HES1;keratinocyte;fibroblast;quercetin
Introduction
皮肤是一种物理屏障，可保护我们免受脱水，紫外线（UV）辐射和传染性病原体的侵害（Fuchs，2007年）。老化会导致人类皮肤特别是眼睛周围的松弛皮肤发生早期发作的形态变化，并出现皱纹以及弹性和功能能力下降（Kohl等人，2011）。据估计，超过80％的老年人患有某些类型的皮肤病，范围从可能危及生命的疾病（例如基底细胞癌，鳞状细胞癌和黑色素瘤）到危险程度较低但更常见的疾病（重症性湿疹） （Deo等人，2015年）。因此，对人类皮肤衰老的深入分子理解具有科学和临床意义。
皮肤由三个主要层组成：表皮，真皮和皮下组织。最外面的表皮是抵抗外部环境的物理屏障（Fuchs，2009）。表皮主要由角质形成细胞组成，包括常驻基底细胞（BC），棘细胞（SC）和颗粒细胞（GC）。此外，表皮还包含抗紫外线的黑素细胞和朗格汉斯细胞（LC），它们介导了对外源病原体的免疫识别（Merad等，2008; Mort等，2015）。相比之下，真皮中充满了复杂的细胞外基质（ECM）和真皮成纤维细胞，可为皮肤提供强度和弹性。真皮中也充满了免疫细胞和内皮细胞。在表皮和真皮之间是真皮-表皮连接（DEJ），这是一个复杂的基底膜区，对细胞间的通讯和凝聚至关重要。作为高度异质性和动态器官，并且由于衰老的复杂性，在单细胞转录组水平上揭示皮肤细胞异质性很重要。
人的表皮每4周进行一次补给（Fuchs，2007）。传统的批量RNA测序仅能提供总体水平上细胞和组织的平均基因表达图，几乎不能用来解释人类表皮细胞的异质性和可塑性（Stuart和Satija，2019）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的出现现在为以单细胞分辨率探索生理和病理转录组变化提供了前所未有的机会，但尚未应用于人类全皮衰老（Han等， 2018; Wang等，2020b; Zhang等，2020）。
人们认为面部皮肤最容易发生与衰老相关的变化（Flament等人，2013），并受到紫外线暴露和内在时间顺序老化引起的外部光老化的影响（Abyzov等人，2012）。机器学习分析表明，眼睛周围皮肤的摄影图像可以作为生物时代准确，无创的生物标记物（Bobrov等人，2018）。在这里，我们从一组不同年龄的健康女性捐献者那里获得了眼睑皮肤样品，并进行了单细胞转录组测序和生物信息学分析。我们确定了十一种具有独特基因表达特征的皮肤细胞类型，并将人类表皮基底细胞分为六个亚群，即它们的转录身份通过分级分化而被分为静态或扩增表皮基底细胞六种亚群。本质上，生长控制转录因子（TF）（成纤维细胞中的HES1和基底细胞中的KLF6）的早期发作下调是细胞类型特异性转录变化的基础。一致地，成纤维细胞中HES1的失活和角质形成细胞中KLF6的失活导致细胞衰老。此外，HES1的激活减轻了皮肤成纤维细胞的衰老。综上所述，这项研究提供了对人类皮肤单细胞水平上特定于细胞类型衰老机制的深入了解，从而促进了对抗衰老相关的皮肤状况和疾病的新型治疗策略的发展。这项研究的数据已上载到《衰老地图集》（https://bigd.big.ac.cn/aging/landscape?project=Human_Skin）。
Results
1.Single-Cell Transcriptome Profiling Identified Different Skin Cell Types and Their Distribution Changes with Age
我们从接受眼睑整形手术，整容手术的不同年龄的健康女性个体获得了人的上眼睑皮肤（图S1A;表S1）。形态分析表明，如先前报道的那样（Haydont等人，2019a; Lorencini等人，2014），表皮厚度，DEJ的卷积和皮肤胶原蛋白密度在衰老过程中不断降低（图1A）。进一步的分析表明，表皮厚度的减少与KRT10标记的棘突层和KRT14标记的基底层的磨损有关（图1B）。在皮肤衰老过程中，观察到各种皮肤细胞类型的细胞密度降低，包括VWF标记的内皮细胞，DCT标记的黑素细胞，CD207标记的LC和ACTA2标记的周细胞（图S1B–S1E）。这些观察结果与年龄相关的血管减少，对紫外线的抵抗力以及对皮肤病原体的防御作用相一致（Ryan，2004）。在皮肤老化期间，p16INK4a阳性细胞积聚在表皮和真皮中（图S1F），表明衰老细胞增加可能是皮肤老化的基础。因此，随着时间的推移细胞逐渐退化的人眼睑皮肤为皮肤衰老的机理研究提供了良好的生物学样品。
为了解决单细胞水平皮肤衰老过程中基因表达的细胞类型特异性改变，我们应用了来自年轻（Y），中年（M）和老年人（O）的9个皮肤样品的scRNA-seq（图1C和S1A；表S1）。经过严格的细胞过滤后，保留了35,678个细胞用于后续分析（图1C和S1G–S1I）。我们使用统一的流形近似和投影（UMAP）可视化了全球人类皮肤细胞群体（图1D），并根据其特定标记物的表达矩阵识别了11种细胞类型，包括BC（KRT14 +），有丝分裂细胞（MC，MKI67 +），vellus毛囊细胞（VHF，SOX9 +，KRT6B +和SFRP1 +），黑素细胞（ME，TYR +和DCT +），SC（KRT10 +），GC（FLG +），内皮细胞（EC，CLDN5 +），免疫细胞（IC，PTPRC +），成纤维细胞（FB，PDGFRA +），周细胞（PT，RGS5 +和PDGFRB +）和眼轮匝肌（OOM，CKM +）（图1D-1F，S1J和S1K）。在年轻，中年和老年供体中，通过单细胞测序捕获的细胞类型的总数和分布具有可比性，这表明皮肤细胞身份可能不会随年龄而改变（图S1L和S1M）。对每种细胞类型的前30个标记基因进行分析，揭示了独特的转录特征和与其独特的生理功能相关的丰富途径（图1G）。例如，包括半染色体组装和ECM组织在内的基因本体论（GO）术语分别丰富了基底细胞和成纤维细胞（图1G）。此外，与衰老和皮肤疾病（例如皮肤癌，黑素瘤）相关的热点基因（Tacutu等人，2018）主要在黑素细胞，内皮细胞和成纤维细胞中鉴定出来（图S1N;表S2和S3），突出了重要性这些细胞类型在皮肤稳态和衰老中的作用。
2.Gene Expression Changes in Different Cell Types during Human Skin Aging at the Single-Cell Resolution
衰老通常会导致转录噪音增加（Nikopoulou等，2019）。通过计算与年龄相关的变异系数以评估变异转录噪声的水平，我们发现成纤维细胞，内皮细胞和周细胞中的衰老累积转录噪声水平高于其他皮肤细胞类型（图S2A），表明脆弱性更高与其他类型细胞相比，成纤维细胞，内皮细胞和周细胞受到年龄相关压力的影响。为了在细胞水平上进一步探索皮肤衰老的机制，我们将数据集分为年轻（Y），中年（M）和老（O）组，并比较了各组之间各个皮肤细胞类型的基因表达模式。为此，我们在至少一种人类皮肤衰老过程中鉴定了数千种差异表达的基因（DEG，avg_logFC> 0.25和p_val_adj <0.05）（图2A和2B）。在年轻人和中年（M / Y）组，中年和老人（O / M）组以及年轻人和老人（O / Y）组之间分别确定了704、325和673个DEG上调。相比之下，在M / Y组，O / M组和O / Y组中分别确定了353、397和489个下调的DEG（图S2B）。值得注意的是，在中年组中已经可以检测到大约一半的O / Y DEG（图2C，S2C和S2D）。对DEG的主成分分析进一步表明，在转录组水平上，中年人接近老年人（图2D），表明人类皮肤衰老的早期发作。
为了识别在老化过程中不断增加或减少的DEG，我们按时间顺序排列了单个样本的数据集，并根据其表达模式对DEG进行了聚类（请参阅STAR方法）。通过这种方式，我们在7种细胞类型中鉴定了458个年龄上调的DEG，在10种细胞类型中鉴定了1,422个年龄下调的DEG（图2E）。 GO富集分析显示，年龄上调的基因主要与细胞因子介导的信号通路和凋亡信号通路有关，而年龄下调的基因主要与上皮细胞增殖和ECM组织有关（图2F）。例如，IFI27编码在炎性皮肤病中被上调的干扰素-α诱导蛋白（Suomela等人，2004），在四种细胞类型中均被上调（图S2E）。与发育过程有关的基因，例如KLF4和KLF6，在衰老的BC，黑素细胞和周细胞中受到抑制（图S2E）。值得注意的是，GO分析显示相似的途径，包括炎症增加和上皮维持减少，这些途径被年龄相关的DEG和中老年组之间确定的DEG丰富（图2F和S2F）。
由于眼睑皮肤每天都暴露在日光照射下，光老化的特征是黑素细胞，LC和血管网络的丢失（图S1B-S1E）和慢性皮肤发炎（Yaar等人，2002），我们研究了光老化的表达水平-皮肤衰老过程中每种细胞类型的相关途径。随着年龄的增长，包括BC，MC，GC和SC在内的几种细胞类型中的NF-κB信号通路均被上调（图S2G），这与高发炎压力是老年人类皮肤的特征相一致（Wang等，2019） ）。随着年龄的增长，对于维持皮肤细胞体内稳态至关重要的DNA修复基因（Moriwaki，2016）也被几种皮肤细胞类型下调，包括BC，MC，EC，周细胞，黑素细胞和成纤维细胞（图2G）。一致地，我们观察到老年皮肤中DNA氧化（8-OHdG阳性细胞），蛋白质氧化（硝基酪氨酸阳性细胞）和紫外线诱导的基因组突变（CPD阳性细胞）的积累（图2H，S2H和S2I） ），所有这些都是光老化的生物标记。
为了进一步探索整个人类皮肤衰老的分子变化，我们对GenAge数据库中与衰老/寿命相关的基因进行了DEG与衰老/寿命相关基因的整合比较分析（Tacutu等人，2018），进一步强调了成纤维细胞在皮肤老化（图S2J;表S3和S4）。此外，从DisGeNET数据库（表S4）（Piñero等人，2017）对衰老的DEG和皮肤疾病相关基因进行的综合比较分析表明，促炎基因如IRF4和CXCL12的表达没有上调。不仅在老年皮肤细胞中，而且在诸如黑素瘤的皮肤疾病中也是如此，这暗示着炎症失调与皮肤状况之间可能存在联系（表S4）。在衰老的皮肤细胞中，包括KLF5和SOX9在内的上皮发育基因也减少了，并且与各种皮肤状况有关（表S4）。总体而言，这些结果表明，在老年人的皮肤中发生了一系列以炎症反应，光损伤和上皮维持障碍为特征的细胞类型特异性分子变化，并且可能导致对与衰老相关的皮肤疾病发展的敏感性增加。
3.Transcriptional Classification of Six Subpopulations of Human Epidermal Basal Cells
分层的表皮在整个生命过程中不断再生，其稳态通过位于基底层的表皮干细胞分裂得以维持（图3A）（Fuchs，2007）。皮肤衰老是否影响表皮干细胞以及如何影响表皮干细胞仍然是未知的。在这里，我们询问了人类表皮BC的异质性。 UMAP分析将所有角质形成细胞分为未分化的表皮基底细胞，其包含三个静态（BC1–3）和增殖性（MC）亚群，而分化的角质形成细胞则包含两个棘突亚群（SC1–2）和终末分化的细胞（GC）（图3B–3G和S3A–S3C）（Cheng等，2018）。增殖的表皮BC进一步分为三个亚群（MC1-3）（图3C和3G）。
伪时间分析证实，表皮角质形成细胞的所有9个亚群的分布与分化轨迹一致（图3H）。从BC1到BC3，干性标记COL17A1（Liu等人，2019）和细胞连接装配相关基因（KRT14和KRT5）的表达水平逐渐降低，而炎症反应基因（S100A9和S100A8）的表达水平逐渐升高（图3D） –3F）。免疫荧光染色还证实了CYP27A1的差异表达水平，CYP27A1是BC3在不同表皮基底细胞中的标志物（图S3D）。 MC1和MC3在转录上分别类似于BC1和BC3，并且可能分别是其自我更新状态（图S3E和S3F）。相比之下，MC2的定义是基底上角蛋白KRT1和KRT10的高表达，它们是角质形成细胞分化的最早标志物（图3G）（Micallef等人，2009），表明MC2是易于分化的基底细胞亚群。分化，并作为未分化的表皮基底细胞和分化的角质形成细胞之间的过渡细胞类型。结合最高表达的COL17A1，我们推断BC1最有可能是粘附在基底膜上的静止基底细胞，这可能产生MC2，这是引发早期上皮分化程序并最终产生分化细胞的瞬时扩增细胞。该轨迹概括了上皮基底细胞的向上分化，形成了分层的皮肤结构，这与经典的上皮自我更新模型（De Rosa和De Luca，2012）以及通过人类皮肤的先前scRNA-seq研究构建的模型（Cheng）相吻合。等，2018）。
4.Gene Expression Changes in Different Subpopulations of Human Epidermal BCs during Skin Aging
接下来，我们问上皮基底细胞亚群对衰老的反应是否不同。从组织染色来看，我们推断年轻和老样品之间的BC，SC和颗粒细胞的相对比例基本一致（图S4A），尽管基底细胞的整个层变薄了，PCNA和Ki67阳性更少在衰老过程中的细胞（图4A和4B），表明由于总表皮角质形成细胞的衰减而成比例地减少。这些亚群在衰老过程中的转录组变化的进一步剖析表明，在老龄群体和年轻群体之间，人类表皮基底细胞的DEG在不同亚群体之间很大程度上重叠（图4C）。我们还通过分层聚类（HC）在每个亚人群中鉴定了与年龄相关的DEG（图4D），这再次表明，其中许多是在亚人群中共享的（图4E）。例如，炎症因子IFI27通常在衰老过程中在表皮基底细胞的六个亚群中上调（BC1-BC3和MC1-MC3）（图S4B）。 CDKN1A是衰老细胞的分子标记，在BC2，MC1和MC2中被上调，而与屏障功能相关的基因（PLAUR，CLDN1和SPRR2D）在衰老过程中在三种以上的基础细胞亚群中被下调（图4E和图4E）。 S4C）。
通常，上调的DEG参与凋亡信号通路和细胞因子介导的炎症途径，而下调的DEG参与上皮细胞的分化和增殖（图4F）。因此，基因集评分分析显示，在包括BC1，BC2，BC3，MC1和MC2在内的五个表皮基底细胞亚群中，DNA修复的基因表达下降（图S4D），进一步解释了老化皮肤中基底细胞的损伤。
最后，我们对每个BC亚群进行了转录调控网络分析，并在每个亚群中发现了优先的转录调节子（图4G）。同样，重要的皮肤发育基因KLF5在BC1和MC1中被下调，而KLF6在静止的表皮基底细胞（BC1-BC3）的所有三个亚群中均从中年被下调（Dang等，2000），是核心下调。在衰老过程中，不同亚群的表皮基底细胞转录调节网络的枢纽处的转录因子（图4H，4I和S4E）。为了弄清KLF6在表皮老化中的作用，我们在人原发性表皮角质形成细胞中使用shRNA敲低了KLF6（图S4F）。衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色显示，敲低KLF6可以促进人原代表皮角质形成细胞的衰老（图4J）。此外，人类原代角质形成细胞中KLF6的下调导致增殖能力降低（图4K）以及促炎性细胞因子IL6的表达和分泌增加（图4L和4M），这与自我更新和细胞因子信号传导的降低相一致在老化的上皮细胞中。因此，这些数据表明，与年龄有关的关键生长控制因子的减少可能是表皮衰老和衰老的重要因素（Dekoninck等，2020）。
5.Gene Expression Changes in Dermal Fibroblasts during Human Skin Aging
皮肤成纤维细胞产生形成皮肤结缔组织的ECM，因此对于伤口愈合至关重要（Rognoni等人，2018）。真皮可分为靠近表皮的乳头状真皮和位于下层的网状真皮（Korosec et al。，2019）。我们通过一组乳头状成纤维细胞和网状成纤维细胞的特征基因进一步定义了人类成纤维细胞的亚群（Haydont等人，2019b; Janson等人，2012; Nauroy等人，2017; Philippeos等人）等人，2018;Solé-Boldo等人，2020）（图5A和5B;表S3）。通过这种方式，我们发现网状成纤维细胞的基因表达特征主要限于FB1和FB2中的成纤维细胞（图5A和5B），其中MFAP5和MGP的表达水平很高（图5C和5D），而FB3显示出更为突出的基因PTGDS和PDPN高表达水平的乳头状成纤维细胞的表达特征（图5A-5C）。一致地，我们观察到乳头状真皮的厚度减少，MFAP5标记的真皮成纤维细胞减少，胶原束变坏，表明在真皮老化过程中发生了与老化有关的全面变化（图5E和S5A）。
我们发现，在皮肤中鉴定出的所有11种细胞类型中，成纤维细胞具有最高水平的衰老相关转录变异性（图S2A）。为了进一步表征皮肤衰老过程中真皮成纤维细胞的变化，我们询问了成纤维细胞中与衰老相关的转录组学变化。除了在上皮基底细胞中观察到的炎性细胞因子产生途径的上调之外，人类皮肤成纤维细胞中与衰老相关的最上调的GO术语是涉及MMP2等基因的ECM分解（图5F和5G）。与细胞增殖的负调控相关的基因在老年的人类皮肤成纤维细胞中也被上调（图5G）。这些上调的GO术语与在老年人皮肤中观察到的ECM缺陷和真皮变薄一致（图5E，5和S5A）。相比之下，根据衰老的真皮成纤维细胞细胞增殖减少的趋势，下调的DEG主要富含GO术语，包括核糖体生物发生和MYC激活途径（图5G）（Mahmoudi等人，2019）。与上皮基底细胞中的那些相似，与DNA损伤修复相关的基因在人类皮肤成纤维细胞中也被下调（图2G），可能导致皮肤衰老。
我们注意到一些TF，例如HES1，IER2，ID3，TSC22D1，GADD45B，ID1和ZFP36（图5F和5H），是衰老的人类皮肤成纤维细胞中最受下调的基因。在SCENIC构建的转录网络中，不仅在成纤维细胞（图5I，5J和S5B）中，而且在包括MC，棘突细胞和GC（图5I）在内的几种类型的上皮细胞中，只有HES1被鉴定为核心调控TF。和5J）。 HES1是Notch信号传导的关键下游靶标（Dhanesh et al。，2016）。值得注意的是，配体-受体相互作用分析显示，随着年龄的增长，FB1和EC之间或FB1和BC1–3之间的JAG1（DLL1）-NOTCH3相互作用降低（图S5C和S5D），并且在成年的成纤维细胞中观察到HES1的下调，表明参与NOCH-HES1轴在维持皮肤稳态中的作用。
6.HES1 Exerted Geroprotective Effects on Dermal Fibroblasts
为了确定人类成纤维细胞衰老的潜在驱动力，我们使用针对MFAP5和波形蛋白阳性的人类原代皮肤成纤维细胞中最下调的TF的shRNA进行了敲低实验（图S6A–S6D）。 SA-β-gal染色显示，敲低HES1，IER2，ID3或TSC22D1可以促进人类原代皮肤成纤维细胞的衰老（图6A和6B）。 此外，HES1或IER2的敲低降低了Ki67阳性和S期细胞的百分比（图6C和6D），表明HES1和IER2对皮肤成纤维细胞具有深远的保护作用。
对人类原代皮肤成纤维细胞进行敲除后，对人类原代真皮成纤维细胞进行全基因组的批量RNA测序分析进一步揭示，上调的基因主要富含GO术语，包括细胞因子产生和p53下游途径，而下调的基因与翻译起始和胞质翻译相关（图6E）和S6E）。值得注意的是，这些GO术语与老年人眼睑成纤维细胞的术语相似，表明HES1的下调是生理成纤维细胞衰老的潜在驱动力。此外，我们确定了在老年人和年轻人皮肤的scRNA-seq数据与具有HES1抑制作用的人类原代成纤维细胞中的RNA-seq数据之间共享的常见细胞因子产生途径（图6F）。
接下来，我们询问HES1的激活是否可以抵消人类成纤维细胞的细胞衰老。异位过表达或CRISPR-dCas9介导的HES1内源性激活保护了人类成纤维细胞免受衰老表型的影响，表现为细胞增殖增加和细胞衰老减弱（图6G-6J，S6F和S6G）。此外，我们观察到原代人成纤维细胞中UV辐射下HES1的下调，这通过补充抗保护性化合物槲皮素来逆转（图S6H）（Geng等，2019a; Geng等，2019b）。最后，槲皮素不仅延缓了紫外线辐照的人类原代皮肤成纤维细胞的细胞衰老，而且还延缓了HES1缺失的人类原代皮肤成纤维细胞的细胞衰老（图6K和S6I-S6J）。总而言之，这些发现指向了一个新平台，用于发现减轻皮肤老化的新干预目标和化合物。
Discussion
在这里，我们根据来自年轻，中年和老年人的眼睑皮肤样品的scRNA测序，介绍了人类皮肤衰老过程的综合纲要。基于此数据集，我们确定了数千种特定于细胞类型的DEG，这些DEG突出了人类皮肤衰老的分子变化。具体而言，慢性炎症的上调和与上皮自我更新有关的途径的下调是衰老皮肤的两个突出特征。参与发育调控的关键TF的细胞类型特异性抑制，例如表皮角质形成细胞中的KLF6和真皮成纤维细胞中的HES1，降低了自我更新的潜能并促进了衰老表型，包括增加的炎症。因此，这些关键因素可以充当上皮损耗，皮肤萎缩和皮肤老化的驱动因素。除了这些可能用于基因疗法以治疗皮肤老化相关疾病的特定于细胞类型的转录因子外，我们的研究还建立了针对人类皮肤老化的小分子化合物的发现途径。
随着年龄的增长，表皮变薄，黑色素细胞和LC的数量减少（Branchet等，1990； Lorencini等，2014）。真皮老化的特征是弹性网的萎缩，以及胶原和弹性纤维变性导致的ECM重塑（Haydont等人，2019a）。解决人类皮肤细胞的细胞异质性及其支撑皮肤衰老表型的动力学具有科学和临床意义。先前的研究报道了衰老小鼠中不同皮肤细胞类型的单细胞转录组谱（Tabula Muris，2020）。然而，值得注意的是，老鼠的皮肤被一层完整的毛发覆盖，并且可以免受紫外线的伤害，因此与人类皮肤相比可能具有遗传和生理上的区别（Zomer和Trentin，2018）。在这项研究中，我们提供了对单细胞转录态势的广泛调查，可以系统地注释人类皮肤细胞类型并精细定位细胞类型特异性衰老调节基因和核心TF的离散集合，以帮助阐明复杂情况。人类皮肤老化的生物学。我们的研究还建立了一个发现管道，用于识别针对人类皮肤衰老和相关疾病的新型治疗靶标或化合物。
